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經典案例

皰疹病毒復制誘導過氧化物酶體生物合成應答

Infection-Induced Peroxisome Biogenesis Is a Metabolic Strategy for Herpesvirus Replication

研究對象:過氧化物酶體 皰疹病毒
發表雜志: Cell Host & Microbe
影響因子:17.872
發表單位:普林斯敦大學
發表時間: 2018年9月10日

研究背景

過氧化物酶體是一種多功能的細胞器,廣泛存在于真核細胞中,在人體中起著重要的作用,過氧化物酶體生物合成異常的患者會出現致命的代謝紊亂和發育缺陷。病毒在感染過程中會靶向宿主的某一細胞器以幫助病毒完成復制、釋放和再次感染。過氧化物酶體在脂質代謝中起著重要作用,它在病毒感染中的作用尚不明確。本文作者研究了皰疹病毒(HCMV)和I型單純皰疹病毒(HSV-1)在感染細胞過程中,過氧化物酶體所發揮的作用。

研究策略

研究結果

1. 人巨細胞病毒(HCMV)感染細胞后上調在過氧化物酶體生物合成和脂類代謝過程中起作用的蛋白

文章在人成纖維細胞中鑒定到60個與過氧化物酶體相關的蛋白,并選取感染早期(immediate early,IE,對應感染時間點6hpi)、中期(delayed early,DE,24 hpi)和末期(late,L,48~120 hpi)的細胞進行靶向蛋白質組定量研究,發現其中的52種蛋白在感染過程中顯著上調(圖 1B),蛋白表達上調發生在病毒感染的中期。為了更好地區分在病毒感染的中期還是后期基因對過氧化物酶體蛋白的表達上調調控,作者對病毒進行了 UV 照射后,用該病毒感染細胞并加入了一種病毒 DNA 復制抑制劑,磷酰基甲酸酯(PFA)。被感染的細胞在病毒感染末期基因表達產物顯著減少,PRM 蛋白質組學實驗表明過氧化物酶體蛋白表達上調不依賴于病毒感染末期的基因調控,而受控于病毒感染早期或中期的基因調控。聚類分析發現,與過氧化物酶體早期合成有關的蛋白在48 hpi 時就已經上調了兩倍,而與脂質代謝有關的蛋白在72 hpi 時達到兩倍上調豐度。差異最顯著的蛋白質是與過氧化物酶體形成相關的蛋白,如與細胞膜形成有關的蛋白 PEX3 和 PEX16,以及基質傳輸(matrix import)相關的蛋白 PEX13 和 PEX14。醚脂和纖溶酶合成發生在感染后期,醚脂合成是過氧化物酶體特有的,而病毒粒子中常聚集大量的纖溶酶(圖1C,圖1D)。基于這些數據,文章假設 HCMV 感染過程中,促進了過氧化物酶體形成,隨后由于宿主的防御或者病毒復制等原因,導致過氧化物酶體脂質代謝發生改變。

2. 感染后期過氧化物酶體數量增加是包膜病毒 HCMV 和 HSV-1 的共同特征

病毒感染后,細胞中的過氧化物酶體在96 hpi 時上調了3.6倍(圖2B,圖2C),病毒感染后加入 PFA 得到了同樣的結果,但是經 UV 照射后的病毒感染后,過氧化物酶體的數量沒有增加(圖2D)。鑒于過氧化物酶體在脂質代謝中的關鍵作用,對過氧化物酶體形成過程的調控可能是幾種病毒的共同特征。尤其是依賴脂質形成病毒包膜的病毒。文章使用了包膜病毒 HSV-1 和非包膜病毒ADV5 進行實驗,感染人成纖維細胞(HFs),結果顯示與 HCMV 類似,HSV-1 感染后期(16 hpi)也出現了過氧化物酶體升高(圖2E,圖2F),而 ADV5 僅在感染的前期(4 hpi,12 hpi)出現過氧化物酶體升高,感染后期(20 hpi)沒有明顯升高(圖2G,圖2H)。以上結果揭示了過氧化物酶體在包膜病毒感染過程中起著重要的作用。

3. 過氧化物酶體對 HCMV 和 HSV-1 病毒的復制是必需的

使用4-丁酸苯酯在人成纖維細胞中誘導生成過氧化物酶體之后,再用 HCMV 和 HSV-1 以及 ADV5 感染,結果顯示與對照相比,過氧化物酶體誘導生成的細胞在被 HCMV 和 HSV-1 感染后含有更多的復制病毒,而被 ADV5 感染后病毒復制沒有明顯增加(圖3A,圖3B)。為了研究過氧化物酶體形成過程中的哪個環節影響病毒的復制,作者使用 CRISPR/Cas9 技術(圖3E)構建了多個基因敲除(細胞膜聚集相關基因 PEX3、PEX19,基質傳輸相關的基因 PEX7,分裂相關的基因 PEX11B)細胞系(圖3C)。結果顯示PEX3 和 PEX19 基因敲除的細胞因阻礙了細胞膜的生成,所以沒有產生過氧化物酶體(圖3D),且存在病毒復制缺陷(圖3F);PEX11B 基因敲除的細胞因阻止了分裂,導致出現變大的和被拉長的過氧化物蛋白酶體(圖3D);PEX7 基因敲除的細胞,也影響了病毒的產出,說明基質傳輸(matrix import)對病毒復制也起著重要的作用。相比較來說 PEX11B 基因敲除的細胞中,HCMV 病毒的復制反而有一定的增加(圖3F)。臨床細胞樣本的實驗結果顯示,PEX1 突變細胞 GM16513,PEX26 突變細胞 GM07371 中,HCMV 病毒的復制比對照低2~3倍,PEX26 另一株突變細胞 GM16866 中病毒基本失去了復制的能力(圖3G)。以上結果顯示過氧化物酶體是 HCMV 病毒復制和輸出的必要因素。

4. 過氧化物酶體的增殖通過已存在的過氧化物酶體的生長和分裂而實現

文章接下來分析了過氧化物酶體在病毒感染過程中是如何增殖的。過氧化物酶體的數量與三個過程有關:從頭生成(kd)、原有的過氧化物酶體分裂(kf)、被吞噬(圖4A)。作者建立了生物化學隨機模型和推理過程,在不干擾過氧化物酶體生物發生系統的情況下,估計過氧化物酶體生物生成率(圖4B)。圖4C 顯示了原始成纖維細胞過氧化物酶體隨時間的數量變化。Kf 似乎是過氧化物酶體的主要來源途徑,是 kd 途徑來源的10~20倍(圖4D)。以上結果表明未感染的 HFs 過氧化物酶體豐度主要來自已存在過氧化物酶體的生長和裂變,而這也是 HCMV 病毒感染過程中過氧化物酶體增殖的途徑。MFF 和 FIS1 是過氧化物酶分裂過程中的兩個相關蛋白,在未感染病毒的 HF 細胞中,MFF 和 FIS1 定位在線粒體上,病毒感染120 hpi 時間點上,觀察到定位在過氧化物酶體上的MFF 和 FIS1 急劇增多(圖4 E-G) 。

5. HCMV 感染改變過氧化物酶體形態,提高過氧化物酶體膜-腔比值

未被感染的 HF 細胞中,過氧化物酶體呈現圓形,尺寸和形狀均一(圖5A)。然而感染后120 hpi 時間點時,觀察到高度增大的和稍微縮小的過氧化物酶體。圖5B 顯示了過氧化物酶體在病毒感染后,表面積和體積均發生變化。感染120 hpi 時間點時,過氧化物酶體在長度、表面積和體積上都明顯增大(圖5C)。因此,在病毒感染細胞后,過氧化物酶體不僅數量增加,平均尺寸也變大。表面積與體積的比值(SA:V)往往與尺寸呈反比,對于不規則形狀,該比值往往大于規則形狀(圖5E)。通過二次方程做圖發現,在 HCMV 感染120 hpi 時,過氧化物酶體的SA:V比值最大(圖5F)。PEX11B 基因敲除的細胞未被感染時,蛋白酶體也增大,呈拉長的形狀,大小不均一,但是呈管狀(圖5G上行);被感染后,呈不均一的扁平狀,并且有的增大,有的縮小(圖5G下行),這與野生型 HF 細胞的120 hpi 時的形狀相似。PEX11B 敲除的細胞在120 hpi 時過氧化物酶體也出現了兩極分化的形狀(圖5H)。這些結果表明:HCMV 導致了過氧化物酶體形態的改變,不依賴過氧化物酶體的分裂,從而提高膜腔比,進而增強促進與過氧化物酶體膜相關的功能,促進病毒復制。

6. 與 HCMV 類似,HSV-1 感染也改變過氧化物酶體的形態,而 ADV5 感染則不同征

在 HSV-1 感染的后期(16 hpi),觀察到了增大的和縮小的過氧化物酶體(圖6A),形狀也呈現兩極分化(圖6B),長度和表面積增加(圖6C),在16 hpi 時SA:V比值升高(圖6D)。而 ADV5 感染后在感染早期(4 hpi)和后期(20 hpi)都沒有發現形態的明顯變化(圖6C,6E)。

7. 過氧化物酶體促進纖溶酶體合成幫助病毒復制

過氧化物酶 GNPAT 和 AGPS,催化纖溶酶合成的前兩個關鍵步驟,纖溶酶前體在 sn-1 位置含有醚鍵烷基(圖7A)。溶酶體富集于 HCMV 病毒膜上,它們的調控和功能尚不明確。為了證明是否感染引起了纖溶酶體的合成,文章用 LC-MS 檢測了 HCMV感染細胞在120 hpi 時的纖溶酶水平(圖7B)。文章鑒定到15種乙醇胺纖溶酶涵蓋3種常見的 sn-1 烷基,8種纖溶酶豐度提高了5倍以上。為了說明纖溶酶體增加是特異性針對過氧化物酶的反應,文章測試了 PEX3 和 PEX11B 敲除細胞中的纖溶酶體(圖7C),結果顯示 PEX3 細胞中的纖溶酶體明顯降低,PEX11B 細胞中纖溶酶體降低不明顯,因為過氧化物酶體的存在仍能促進其合成(圖7D)。GNPAT 敲除不影響 DE 和 L 病毒基因(圖7E),卻能降低病毒在上清和細胞中的合成(圖7F)。這些結果說明纖溶酶體合成不是病毒胞外分泌和病毒基因表達所需要的,卻是病毒的二次組裝和下一次感染所必需的(圖7G)。

參考文獻

Pierre M. et al., Infection-Induced Peroxisome Biogenesis Is a Metabolic Strategy for Herpesvirus Replication, 2018, Cell Host & Microbe: 24, 1-16.

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